TNT 無細胞発現ガイド

in vitro転写･翻訳

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TNT® 無細胞発現ガイド 便利な転写＆翻訳 1チューブシステム Contents： • イントロダクション • ウサギ網状赤血球ライセート システム • 昆虫細胞抽出液システム • 小麦胚芽抽出液システム • 大腸菌抽出液システム 2 Wizard 核酸精製シリーズ 検出 アッセイ B B AP AP F F F Radioisotope （発色） TranscendTM （発色または化学発光） FluorTectTM （蛍光） HaloTag® Ligand （蛍光） HisLinkTM （担体） HaloLinkTM （担体） MagneGSTTM （担体） プラスミド、PCR産物 TNT® 無細胞発現試薬 標識アミノ酸 （TranscendTM, FluoroTectTM, 35S-Met など） TNT® 反応 （最短1時間） インキュベーション 60～90分、30℃ タンパク質 検出 アッセイ タンパク質 Transcription and Translation (TNT® ) 転写反応と翻訳反応を1チューブ内で行います。 最も簡便・迅速なタンパク質発現システム タンパク質の発現実験は非常に煩雑で、結果が得られるまでに数多くの工程が含まれ、多大の労力を必要とします。無細胞発 現システムは細胞ベースの発現系に比べてよりシンプルにタンパク質を取得することができます。 標準的な無細胞発現系では、まず転写反応（鋳型DNAからのRNA合成）から得られたRNA を翻訳反応（RNAからのタンパク質 合成）に利用する2ステップ法が一般的に用いられています。プロメガのTNT®システムは1チューブの中で転写反応と翻訳反応 を行うことができるため、取扱の困難なRNAの精製を省略できるためより簡便で効率的なタンパク質発現を行うことができま す。また、多くのシステムでマスターミックスとして試薬が供給されるため、分注ステップを大幅に削減できます。 DNA を直接 TNT® 試薬 またはS30試薬に添加 アプリケーションでの使用 TNT® or S30 System 1-4 Hour Total: 1-4 Hour Total: 4-5 DAYS トランスフォーメーション および一昼夜培養 誘導およびタンパク質発現 精製/透析 アプリケーションでの使用 E. coli expression DAY 1 DAY 2-3 DAY 4 7674MA Total: 18-21 DAYS 直鎖化したウイルスDNA および組換えベクターを 昆虫細胞にトランスフェクション プラークを選定し、プレーティング プラークを選定 ウイルスストック アプリケーションでの使用 Cell-based baculovirus expression 4 DAYS 4 DAYS 3 DAYS 昆虫細胞に感染させ、 タンパク質を発現 3 DAYS 4 DAYS 無細胞発現システムの利点 • 培養細胞/菌体ベースの発現システムに比べ迅速（数日の 工程が数時間に短縮され、スクリーニング等にも最適。） • 柔軟性のあるタンパク質発現系（タンパク質の標識が容 易で抗体が無くても検出できます。キナーゼなど毒性の あるタンパク質も発現可能） • 用途によってシステムを選択可能（真核生物系は活性/溶 解性、原核生物系は収量が期待されます） TNT® システムと菌体 / 細胞を用いた発現システムの操作時間 無細胞発現タンパク質の標識とタグを付加した場合の捕捉 ※標識試薬、捕捉用担体については 8 ページをご覧ください。 TNT® システムの操作概要 鋳型となる DNA および標識アミノ酸（オプション）を TNT® 反応に加え れば、数時間後に発現タンパク質を用いた実験を開始することができます。 B B AP AP F F F TranscendTM （発色または化学発光） FluorTectTM （蛍光） HaloTag® Ligand （蛍光） HisLinkTM, MagneHisTM （担体） HaloLinkTM （担体） MagneGSTTM （担体） 標識 捕捉 HaloTag® GST Tag His Tag リジン AP アビジン – アルカリホスファターゼ B ビオチン 蛍光物質 F TNT® 無細胞発現ガイド 3 Transcription and Translation (TNT® ) 収量やアプリケーションに応じて4タイプを揃えています 哺乳動物・昆虫・植物・大腸菌 無細胞発現系は一般に細胞ベースの発現系に比べ収量が低いことが懸念されてきました。しかし、無細胞発現システムや発現 ベクターの改良、新規タグの開発等により、発現量や検出感度の向上が実現し、従来よりも応用範囲が広がっています。無細 胞発現系の特長であるスピード、簡便性、ミニチュア化の容易さなどを含め、タンパク質発現系として有効な選択肢の1つに なっています。 Tag B P* P* S Tag B P* 混和 Bait タンパク質の無細胞発現 Prey タンパク質の無細胞発現 RNA プロモーター bait タンパク質配列を 含むプラスミド Preyタンパク質配列を 含むプラスミド Bait 配列 Prey 配列 Bait Prey 捕捉用担体 * RI 標識 Tag B Tag 配列 RNA プロモーター 洗浄および複合体の溶出 電気泳動および オートラジオグラフィーによる検出 S システム 鋳型 アプリケーション 製品名 抽出液由来 環状 DNA 直鎖状 DNA RBS* 要求 Kozak 推奨 真核生物 タンパク 質分析 原核生物 タンパク 質分析 構造 解析 収量※ 真 核 TNT® Quick Coupled Transcription/ Translation System ウサギ網状 赤血球 P P P P 最大 300ng TNT® T7 Insect Cell Extract Protein Expression System 昆虫 培養細胞 P P P 最大 4µg TNT® SP6 High-Yield Wheat Germ Protein Expression System 小麦胚芽 P P P P 最大 5µg 原 核 S30 T7 High-Yield Protein Expression System 大腸菌 P P P P 最大 25µg ・上記以外の TNT® System についてはお問い合わせください。 ※ 50µl 反応あたりの収量 *RBS : ribosomal binding site（リボゾーム結合サイト） GST Resin 5612TA HaloLink™ Resin GST-Binding Resin HaloLink™ pull-down GST pull-down GST-Fos – (prey) – Jun-HaloTag® Fusion (prey) Jun-HT (bait) Control GST-Fos (bait) Control HaloLinkTM Fos* GST* HT Jun Prey bait Fos GST HT* Jun* Prey bait * 35S 標識タンパク質 共有結合タグである HaloTag® および HaloLinkTM Resin を 用いたプルダウン法と標準的な GST を用いたプルダウン法 の比較 GST-c-Fos および c-Jun-HaloTag® 融合タンパク質を無細胞 発現系で合成し、互いに bait（未標識）あるいは prey（35 [S]- メチオニン標識）として用いた。合成完了後、未標識タン パク質および標識タンパク質パートナーからなる 2 組の反 応液を混合し、タンパク質を結合させた。HaloLink TM Resin ( 左パネル ) または GST- 結合レジン ( 右パネル ) を用いて、 タンパク質複合体をプルダウンした。左レーン : HaloLinkTM ま た は GST レ ジ ン を 用 い た GST-c-Fos ま た は c-JunHaloTag® タンパク質のプルダウン。右レーン : HaloLinkTM または GST レジンのみ。 無細胞発現系で得た bait および prey を用いたプルダウン 標準的なプルダウンアッセイでは、担体に結合するベイト (bait) タンパク質濃度を高く するために大腸菌発現系が汎用され、アフィニティータグである GST との組合わせが 多く見られます。HaloTag® と HaloLinkTM （担体）は強力な親和性（共有結合）を有し、 HaloLinkTM への非特異的結合が最低限に抑えられているため無細胞発現タンパク質を bait/prey の両方に用いることも可能になります。 プロメガの無細胞発現システム 4 ウサギ網状赤血球ライセート TNT® Quick Coupled Transcription/ Translation System 幅広いベクターよりタンパク質を発現し、修飾タンパク質も発現可能 TNT® Quick Systemsは、転写と翻訳を1チューブ内で連続して行えるより簡単で迅速なシステムです。TNT® Quick Master Mix には、転写用のRNAポリメラーゼや翻訳用のウサギ網状赤血球ライセートなどin vitro 転写/翻訳に必要なあらゆる試薬が含まれ ます (鋳型DNAと検出用の標識物質を除く)。T7またはSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを含む環状プラスミドまたはT7プロ モーターを含むPCR産物を標識物質とともにTNT® Quick Master Mixに加え、30℃、60-90分間インキュベーションするだけで す。別売のミクロゾームメンブレンを転写/翻訳反応に添加することによりタンパク質の修飾やプロセシングを再現することも 可能です（タンパク質に依存）。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3701TA04_2A SP6 Reaction T7 Reaction TNT® Quick Vendor Y Vendor X3702MA04_2A Activity Protein Levels 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Percent TNT® Systems Vendor X Vendor Y Protein Levels Activity SP6 Systems T7 Systems ルシフェラーゼタンパク質のウェスタン分析 TNT® Quick System（レーン 1-3）または Vendor Y（レーン 4-6）およ び Vendor X（レーン 7-9）の 2 段階転写翻訳システムの反応液 3µl を ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。 Anti-Luciferase pAb（カタログ番号 G7451）、Donkey Anti-Goat IgG HRP Conjugate（カタログ番号 V8051）を利用した化学発光検出によ り可視化した。レーン 1, 4, 7 は DNA を含まないネガティブコントロー ル反応 ルシフェラーゼ活性およびタンパク質レベルにおける競合品との比較 競合品 X と Y とのルシフェラーゼの相対活性およびタンパク質レベ ルを比較した（TNT® Quick System の値を 100％とした場合）。 7871TA M 123456 7 8 9 10 11 12 M 123456 7 8 9 10 11 12 A. B. 真核生物由来のタンパク質発現 転写 / 翻訳反応は TNT® Quick Coupled Transcription/Translation System ( カタログ番号 L1170) および FluoroTect TM GreenLys tRNA ( カタログ番 号 L5001) (1 µl) を用いて行った。反応後、5µl を分取し、導入されなかっ た FluoroTect TM tRNA を除去するために RNase-ONETM で処理し、SDSPAGE に供した。レーン 1. 蛍光マーカー、レーン 2. ネガティブコントロー ル（No-DNA）、レーン 3-12（下表参照）、レーン 13. ルシフェラーゼ。 無細胞発現でテストした溶解性の低いヒト – タンパク質 レーン タンパク質 ACCN 3 Small muscular protein BC005948 4 Melanoma antigen recognized by T cells (MLANA) BC014423 5 B-cell translocation gene 1 anti-proliferative NM_001731 6 Caspase-6, apoptosis-related cysteine protease BC000305 7 Mitogen-activated protein kinase 14 NM_001315 8 Cytochrome P450, family 3, subfamily A, polypeptide 4 NM_017460 9 Protein kinase C, gamma NM_002739 10 Minichromosome maintenance deficient 5 cell division cycle 46 NM_006739 11 v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 NM_004448 12 Protein tyrosine phosphatase, receptor-type, Z polypeptide 1 NM_002851 ACCN indicates GenBank® accession number. 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） TNT® 無細胞発現システム（ウサギ網状赤血球） 発現システム TNT® T7 Quick Coupled Transcription/ Translation System 40 回分 L1170 68,000 5 回分 L1171 18,000 TNT® SP6 Quick Coupled Transcription/ Translation System 40 回分 L2080 78,000 5 回分 L2081 20,000 内容： • TNT® Quick Master Mix • SP6 or T7 Luciferase Control DNA • T7 TNT® PCR Enhancer (L1170 only) • Methionine • Luciferase Assay Reagent (L1170, L2080 only) • Nuclease-Free Water (L1170, L2080 only) • Protocol 保存条件：-70℃ プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/tntqck.html TNT® 無細胞発現ガイド 5 昆虫細胞抽出液 TNT® Insect Cell Extract Protein Expression System 最大 75µg/ml のタンパク質を合成、より活性のあるタンパクを発現 TNT® T7 Insect Cell Extract Protein Expression System は、タンパク質の無細胞発現システムで、1 チューブで転写／翻訳を行 う便利、迅速なシステムです。タンパク質合成反応は鋳型 DNA の添加で開始され、手間のかかる in vitro での RNA 合成を行う 必要はありません。抽出液は汎用される Spodoptera frugiperda Sf21 細胞株より調製されています。転写 / 翻訳に必要な全て の成分は TNT® T7 ICE Master Mix に含まれています。反応液に鋳型 DNA を加えて 28–30℃インキュベーションすれば 4 時間 以内にタンパク質合成が完了します。 専用のベクター（pF25A および pF25K）には、翻訳効率を向上させるためにクローニング領域の 5′ および 3′ 末端にバキュロ ウイルス ポリヘドリン遺伝子の非翻訳領域（UTR）配列が含まれており、本システムで最適な収量が得られるようにデザインさ れています。TNT® T7 Insect Cell Extract Protein Expression System およびこれらのベクターを使用することにより 最大 75µg/ ml の機能性タンパク質を調製することができます。 0 10 20 30 40 60 50 80 70 15 20 75 45 Yield (µg/ml) Firefly Luciferase Renilla Luciferase HaloTag® Procaspase-3 Protein 7675MA 7645MB pF25A ICE T7 Flexi® Vector (3947bp) Ampr ori cer SgfI Barnase PmeI 3´ polyhedrin UTR T7 terminator T7 5´ polyhedrin UTR (dA:dT)30 7646MB pF25K ICE T7 Flexi® Vector (3942bp) Kanr ori cer 3´ polyhedrin UTR T7 terminator T7 5´ polyhedrin UTR SgfI PmeI Barnase (dA:dT)30 7671TA M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213 19 26 50 80 125 kD ヒト – プロテインキナーゼの発現 11 種のヒト – キナーゼ遺伝子を pF25A または pF25K T7 ICE Flexi ® Vector にクローニングし、4µg の精製プラスミドを 50µl TNT® 反応に 使用した。FluoroTect TM GreenLys tRNA ( カタログ番号 L5001) (1 µl) を 各反応に添加し、4 時間インキュベーションした。各反応液から 1µl をサンプルバッファーに加え、4-20% トリス – グリシンゲルに添加し た。レーン M, molecular weight markers (Cambrex); レーン 1, pF25Aルシフェラーゼポジティブポジティブコントロール ; レーン 2 から 12 : AURKC, MAPK1, AURKB, PKA, MAPK14, AURKA, SRC, SYK, PKC gamma, AKT, PI3K; レーン 13, DNA なし（ネガティブコントロール）; レーン 14, DNA なし、FluoroTect TM GreenLys tRNA 不含（ネガティブコ ントロール）。 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） TNT® 無細胞発現システム（Sf21 昆虫細胞） 発現システム TNT® T7 Insect Cell Extract Protein Expression System 40 回分 L1102 82,000 10 回分 L1101 23,000 内容： • TNT® T7 ICE Master Mix • Luciferase ICE T7 Control DNA • Nuclease-Free Water • Protocol ベクター pF25A T7 Flexi® Vector 20µg L1061 48,000 pF25K T7 Flexi® Vector 20µg L1081 48,000 保存条件：-70℃（発現システム）、-20℃（ベクター） プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/tntice.html TNT® T7 Insect Cell Extract Protein Expression System で 得られたタンパク質収量 pF25A/K T7 Flexi ® Vector のベクターマップ 6 小麦胚芽抽出液 TNT® SP6 High-Yield Protein Expression System 最大 100µg/ml のタンパク質を合成、可溶性タンパクを発現 TNT® High Yield Protein Expression System は、簡便、迅速にシングルチューブで転写/翻訳のカップリング反応を行うためにデ ザインされており、最大100µg/mlのタンパク質収量が得られます。この無細胞発現システムには最適化された小麦胚芽抽出液 をはじめ鋳型DNAから直接タンパク質を合成するために必要な全ての成分（tRNA、リボゾーム、アミノ酸、ポリメラーゼ、翻 訳開始・伸張・停止因子）が含まれています。このシステムはSP6プロモーターの下流にクローニングされた遺伝子を発現し ます。タンパク質の合成は適切な鋳型DNAの添加で開始しされ、25℃で2時間インキュベーションするだけです。合成タンパ ク質はSDS-PAGEによる分析、あるいはその他様々なアプリケーションにそのまま使用できます。 最大100µg/ml のタンパク質 を発現するようにデザインされていますが、透析システムを利用することにより最大 200-400µg/ml の収量が得られるため、タ ンパク質の機能、構造分析にも利用することが可能です。 pF3A WG（BYDV）およびpF3K WG（BYDV）Flexi ® Vectorは、小麦胚芽抽出液を用いたin vitro発現用にデザインされていま す。オオムギ黄萎ウイルス（BYDV）由来の 5′ および 3′ UTR配列が目的のタンパク質コード領域クローニングサイトの上下流に 配置されています。これらBYDV上下流UTRエレメントの相互作用により閉ループが形成され、mRNAキャッピングやポリアデ ニル化に対する依存性を回避した相乗的な翻訳が促進されます。 4910MA pF3A WG (BYDV) Flexi ® Vector (3,689bp) ori cer Pme I Barnase BYDV 5´ UTR T7 Terminator Ampr Sgf I BYDV 3´ TE T7 rrnB Terminator SP6 7516TA TNT® High-Yield Protein Expression System と大腸菌で発現できた完全 長タンパク質数の比較 ヒト 55 種類のタンパク質で試験した結果、High-Yield Protein Expression System は大腸菌に比べて多くの完全長タンパク質を発現した。 60 50 40 30 20 10 0 Number of expressed full-length proteins E. coli expression TNT ® High-Yield Protein Expression System 55/55 3/55 7513MA TNT® High-Yield Protein Expression System を用いた タンパク質の合成 タンパク質は 8µg プラスミド DNA を用いて透析法を利用して発現 させた。レーン 1. ホタル – ルシフェラーゼ (62kDa)、レーン 2. GFP (28kDa) 、レーン 3. ウミシイタケルシフェラーゼ (36kDa)。 透析法については Promega Notes No. 94 を参照ください。 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） TNT® 無細胞発現システム（小麦胚芽） 発現システム TNT® SP6 High-Yield Protein Expression System 40 回分 L3260 75,000 10 回分 L3261 22,000 内容： • TNT® SP6 High-Yield Master Mix • Nuclease-Free Water • Protocol ベクター pF3A WG (BYDV) Flexi® Vector 20µg L5671 45,000 pF3K WG (BYDV) Flexi® Vector 20µg L5681 45,000 保存条件：-70℃（発現システム）、-20℃（ベクター） プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/tntwghigh.html pF3A WG (BYDV) Flexi ® Vector のベクターマップ TNT® 無細胞発現ガイド 7 大腸菌抽出液 S30 T7 High-Yield Protein Expression System 最大 500µg/ml のタンパク質を合成 E. coli S30 T7 High-Yield Protein Expression Systemは、T7プロモーターおよびリボゾーム結合サイト (RBS) を含むベクターから 約1～数時間以内に最大500µg/mlのタンパク質を発現するようにデザインされています。システムに付属する抽出液にはT7 RNA ポリメラーゼが含まれており、OmpTエンドプロテイナーゼやIonプロテアーゼ活性が欠失しています。 また、システムに含まれ るその他の必要な試薬はタンパク質の翻訳に最適化されています。これにより、標的タンパク質の安定性が向上し、発現レベル が増加します。発現タンパク質は Coomassie® 染色や 蛍光/ビオチン修飾 tRNAの導入により検出することができます。 7637TA 100 75 50 35 25 15 kDa 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 A. B. C. BCCP 環状 DNA からのタンパク質発現 タンパク質コード領域をクローニングした pFN6A (HQ) Flexi ® Vector および FluoroTect TM または TranscendTM tRNA を用いて S30 T7 HighYield Protein Expression System でタンパク質を発現させ、SDS-PAGE で分離後、Coomassie® blue 染色 ( パネル A)、蛍光スキャニング ( パネル B) あるいは PVDF 膜に転写した後、Streptavidin Alkaline Phosphatase ( カタログ番号 V5591) で処理し、Western Blue® Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase ( カタログ番号 S3841; パネル C) で検出した。レーン 1, DNA なし ; レーン 2, ウミシイタケルシフェラー ゼ ; レーン 3, Monster Green® 蛍光タンパク質 ; レーン 4, HaloTag® タンパク質 ; レーン 5, β – ガラクトシダーゼ (BCCP = E. coli biotin carboxyl carrier protein)。 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） TNT® 無細胞発現システム（大腸菌） 発現システム S30 T7 High-Yield Protein Expression System 24 回分 L1110 65,000 8 回分 L1115 25,000 内容： • T7 S30 Extract, Circular • S30 Premix Plus • S30 T7 Control DNA • Nuclease-Free Water • Protocol 保存条件：-70℃ プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/s30t7hy.html S30 T7 HighYield System による GFP の発現 1ml 反応液に 20µl の 鋳型 DNA (pFN6A-MonsterGreen® GFP) をセッ トし、各タイムポイントごとに 50µl を分取した。各反応液は、それ ぞれの表示時間が経過した後反応を停止させるために -20℃で保存 し、全ての反応時間が経過した時点で蛍光を観察した。 7636MA T7 S30 Extract, Circular S30 Premix Plus Circular DNA template with T7 promoter Incubate at 37°C for 1 hour with vigorous shaking. Detect target protein. T7 terminator T7 Protein of interest RBS S30 T7 HighYield System の操作概要 Reaction time (hrs) 1 2 4 6 8 22 テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982 ● E-Mail : prometec@jp.promega.com 日本語 Web site：www.promega.co.jp プロメガ株式会社 本 社 〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所 〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2008年12月現在のものであり予告なしに変更することがあります。 PK0812-02 販売店： 無細胞発現関連ツール 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 発現用ヒト -ORF クローン HaloTag® N 末端融合ヒト – タンパク質発現クローン Flexi® HaloTag® Type 1 クローン FHCxxxxx 50,000 pFN21A をベースとしたヒト ORF クローンで T7 プロモーターを含むた め真核生物由来の無細胞発現系にもそのままご利用いただけます。 ヒト – タンパク質発現クローン（タグ無し） Flexi® Cloning Type 1 クローン FXCxxxxx 30,000 pF1K をベースとしたヒト ORF クローンで T7 プロモーターおよび RBS を含むため原核生物由来の無細胞発現系にそのままご利用いただけます。 無細胞発現用ヒト -ORF クローンの詳細、オンライン注文については www.promega.co.jp/flexiclone/ をご覧下さい。 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 発現用ベクター HaloTag® N 末端融合 pFN19A (HaloTag® 7) T7 SP6 Flexi® Vector 20µg G1891 48,000 pFN19K (HaloTag® 7) T7 SP6 Flexi® Vector 20µg G1841 48,000 HaloTag® C 末端融合 pFC20A (HaloTag® 7) T7 SP6 Flexi® Vector 20µg G1681 48,000 pFC20K (HaloTag® 7) T7 SP6 Flexi® Vector 20µg G1691 48,000 HQ タグ N 末端融合 pFN6A (HQ) Flexi® Vector 20µg C8511 45,000 pFN6K (HQ) Flexi® Vector 20µg C8521 45,000 HQ タグ C 末端融合 pFC7A (HQ) Flexi® Vector 20µg C8531 45,000 pFC7K (HQ) Flexi® Vector 20µg C8541 45,000 GST タグ N 末端融合 pFN2A (GST) Flexi® Vector 20µg C8461 45,000 pFN2K (GST) Flexi® Vector 20µg C8471 45,000 タグ なし pF1A T7 Flexi® Vector 20µg C8441 42,000 pF1K T7 Flexi® Vector 20µg C8451 42,000 ※上記 Flexi ® Vector についての詳細は www.promega.co.jp/flexicloning/ をご覧下さい。 ※ HaloTag® は新規なリガントと特異的に結合する受け皿タンパク質。 蛍光リガンド、ビオチンリガンドなどを用いて細胞内イメージング、 タンパク質間相互作用実験に使用（www.promega.co.jp/halotag/） ※ HQ タグは His タグに変わる金属結合タグで低濃度イミダゾールでの 溶出が可能 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） タンパク質の標識 蛍光検出（タグ – タンパク質） HaloTag® TMR Ligand 15µl G8252 45,000 30µl G8251 75,000 HaloTag® AlexaFluor® 488 Ligand 15µl G1002 45,000 30µl G1001 75,000 ※その他の蛍光リガンドについてはお問い合せ下さい。 蛍光検出 FluoroTectTM GreenLys in vitro Translation Labeling System 40 回分 L5001 50,000 化学発光検出 TranscendTM Chemiluminescent Non-Radioactive Translation Detection System 30 回分 L5080 43,000 発色検出 TranscendTM Colorimetric Non-Radioactive Translation Detection System 30 回分 L5070 30,000 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） タンパク質の捕捉 / 固定 HaloTag® 融合タンパク質の捕捉 HaloLinkTM Magnetic Beads 1ml G9311 16,000 HaloLinkTM Resin 2ml G1911 27,000 5ml G1912 58,000 GST 融合タンパク質の捕捉 MagneGSTTM Particles 4ml V8611 18,000 20ml V8612 65,000 His/HQ 融合タンパク質の捕捉 HisLinkTM Protein Purification Resin 50ml V8821 44,000 5ml V8823 5,000 MagneHisTM Ni-Particles 2ml V8560 19,000 10ml V8565 65,000 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） タンパク質のプロセシング ミクロゾームメンブレン Canine Pancreatic Microsomal Membranes 50µl Y4041 39,000 Templates, Labeling, Processing 発現実験のリソースから検出までをサポート 無細胞発現系に使用できる鋳型としてヒトORFが組込まれたクローンや発現ベクター、標識アミノ酸、タンパク質修飾研究に 利用できるミクロゾームメンブレンもご利用いただけます。 TNT® 無細胞発現ガイド 便利な転写＆翻訳 1チューブシステム Contents： • イントロダクション • ウサギ網状赤血球ライセート システム • 昆虫細胞抽出液システム • 小麦胚芽抽出液システム • 大腸菌抽出液システム 2 Wizard 核酸精製シリーズ 検出 アッセイ B B AP AP F F F Radioisotope （発色） TranscendTM （発色または化学発光） FluorTectTM （蛍光） HaloTag® Ligand （蛍光） HisLinkTM （担体） HaloLinkTM （担体） MagneGSTTM （担体） プラスミド、PCR産物 TNT® 無細胞発現試薬 標識アミノ酸 （TranscendTM, FluoroTectTM, 35S-Met など） TNT® 反応 （最短1時間） インキュベーション 60～90分、30℃ タンパク質 検出 アッセイ タンパク質 Transcription and Translation (TNT® ) 転写反応と翻訳反応を1チューブ内で行います。 最も簡便・迅速なタンパク質発現システム タンパク質の発現実験は非常に煩雑で、結果が得られるまでに数多くの工程が含まれ、多大の労力を必要とします。無細胞発 現システムは細胞ベースの発現系に比べてよりシンプルにタンパク質を取得することができます。 標準的な無細胞発現系では、まず転写反応（鋳型DNAからのRNA合成）から得られたRNA を翻訳反応（RNAからのタンパク質 合成）に利用する2ステップ法が一般的に用いられています。プロメガのTNT®システムは1チューブの中で転写反応と翻訳反応 を行うことができるため、取扱の困難なRNAの精製を省略できるためより簡便で効率的なタンパク質発現を行うことができま す。また、多くのシステムでマスターミックスとして試薬が供給されるため、分注ステップを大幅に削減できます。 DNA を直接 TNT® 試薬 またはS30試薬に添加 アプリケーションでの使用 TNT® or S30 System 1-4 Hour Total: 1-4 Hour Total: 4-5 DAYS トランスフォーメーション および一昼夜培養 誘導およびタンパク質発現 精製/透析 アプリケーションでの使用 E. coli expression DAY 1 DAY 2-3 DAY 4 7674MA Total: 18-21 DAYS 直鎖化したウイルスDNA および組換えベクターを 昆虫細胞にトランスフェクション プラークを選定し、プレーティング プラークを選定 ウイルスストック アプリケーションでの使用 Cell-based baculovirus expression 4 DAYS 4 DAYS 3 DAYS 昆虫細胞に感染させ、 タンパク質を発現 3 DAYS 4 DAYS 無細胞発現システムの利点 • 培養細胞/菌体ベースの発現システムに比べ迅速（数日の 工程が数時間に短縮され、スクリーニング等にも最適。） • 柔軟性のあるタンパク質発現系（タンパク質の標識が容 易で抗体が無くても検出できます。キナーゼなど毒性の あるタンパク質も発現可能） • 用途によってシステムを選択可能（真核生物系は活性/溶 解性、原核生物系は収量が期待されます） TNT® システムと菌体 / 細胞を用いた発現システムの操作時間 無細胞発現タンパク質の標識とタグを付加した場合の捕捉 ※標識試薬、捕捉用担体については 8 ページをご覧ください。 TNT® システムの操作概要 鋳型となる DNA および標識アミノ酸（オプション）を TNT® 反応に加え れば、数時間後に発現タンパク質を用いた実験を開始することができます。 B B AP AP F F F TranscendTM （発色または化学発光） FluorTectTM （蛍光） HaloTag® Ligand （蛍光） HisLinkTM, MagneHisTM （担体） HaloLinkTM （担体） MagneGSTTM （担体） 標識 捕捉 HaloTag® GST Tag His Tag リジン AP アビジン – アルカリホスファターゼ B ビオチン 蛍光物質 F TNT® 無細胞発現ガイド 3 Transcription and Translation (TNT® ) 収量やアプリケーションに応じて4タイプを揃えています 哺乳動物・昆虫・植物・大腸菌 無細胞発現系は一般に細胞ベースの発現系に比べ収量が低いことが懸念されてきました。しかし、無細胞発現システムや発現 ベクターの改良、新規タグの開発等により、発現量や検出感度の向上が実現し、従来よりも応用範囲が広がっています。無細 胞発現系の特長であるスピード、簡便性、ミニチュア化の容易さなどを含め、タンパク質発現系として有効な選択肢の1つに なっています。 Tag B P* P* S Tag B P* 混和 Bait タンパク質の無細胞発現 Prey タンパク質の無細胞発現 RNA プロモーター bait タンパク質配列を 含むプラスミド Preyタンパク質配列を 含むプラスミド Bait 配列 Prey 配列 Bait Prey 捕捉用担体 * RI 標識 Tag B Tag 配列 RNA プロモーター 洗浄および複合体の溶出 電気泳動および オートラジオグラフィーによる検出 S システム 鋳型 アプリケーション 製品名 抽出液由来 環状 DNA 直鎖状 DNA RBS* 要求 Kozak 推奨 真核生物 タンパク 質分析 原核生物 タンパク 質分析 構造 解析 収量※ 真 核 TNT® Quick Coupled Transcription/ Translation System ウサギ網状 赤血球 P P P P 最大 300ng TNT® T7 Insect Cell Extract Protein Expression System 昆虫 培養細胞 P P P 最大 4µg TNT® SP6 High-Yield Wheat Germ Protein Expression System 小麦胚芽 P P P P 最大 5µg 原 核 S30 T7 High-Yield Protein Expression System 大腸菌 P P P P 最大 25µg ・上記以外の TNT® System についてはお問い合わせください。 ※ 50µl 反応あたりの収量 *RBS : ribosomal binding site（リボゾーム結合サイト） GST Resin 5612TA HaloLink™ Resin GST-Binding Resin HaloLink™ pull-down GST pull-down GST-Fos – (prey) – Jun-HaloTag® Fusion (prey) Jun-HT (bait) Control GST-Fos (bait) Control HaloLinkTM Fos* GST* HT Jun Prey bait Fos GST HT* Jun* Prey bait * 35S 標識タンパク質 共有結合タグである HaloTag® および HaloLinkTM Resin を 用いたプルダウン法と標準的な GST を用いたプルダウン法 の比較 GST-c-Fos および c-Jun-HaloTag® 融合タンパク質を無細胞 発現系で合成し、互いに bait（未標識）あるいは prey（35 [S]- メチオニン標識）として用いた。合成完了後、未標識タン パク質および標識タンパク質パートナーからなる 2 組の反 応液を混合し、タンパク質を結合させた。HaloLink TM Resin ( 左パネル ) または GST- 結合レジン ( 右パネル ) を用いて、 タンパク質複合体をプルダウンした。左レーン : HaloLinkTM ま た は GST レ ジ ン を 用 い た GST-c-Fos ま た は c-JunHaloTag® タンパク質のプルダウン。右レーン : HaloLinkTM または GST レジンのみ。 無細胞発現系で得た bait および prey を用いたプルダウン 標準的なプルダウンアッセイでは、担体に結合するベイト (bait) タンパク質濃度を高く するために大腸菌発現系が汎用され、アフィニティータグである GST との組合わせが 多く見られます。HaloTag® と HaloLinkTM （担体）は強力な親和性（共有結合）を有し、 HaloLinkTM への非特異的結合が最低限に抑えられているため無細胞発現タンパク質を bait/prey の両方に用いることも可能になります。 プロメガの無細胞発現システム 4 ウサギ網状赤血球ライセート TNT® Quick Coupled Transcription/ Translation System 幅広いベクターよりタンパク質を発現し、修飾タンパク質も発現可能 TNT® Quick Systemsは、転写と翻訳を1チューブ内で連続して行えるより簡単で迅速なシステムです。TNT® Quick Master Mix には、転写用のRNAポリメラーゼや翻訳用のウサギ網状赤血球ライセートなどin vitro 転写/翻訳に必要なあらゆる試薬が含まれ ます (鋳型DNAと検出用の標識物質を除く)。T7またはSP6 RNAポリメラーゼプロモーターを含む環状プラスミドまたはT7プロ モーターを含むPCR産物を標識物質とともにTNT® Quick Master Mixに加え、30℃、60-90分間インキュベーションするだけで す。別売のミクロゾームメンブレンを転写/翻訳反応に添加することによりタンパク質の修飾やプロセシングを再現することも 可能です（タンパク質に依存）。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 3701TA04_2A SP6 Reaction T7 Reaction TNT® Quick Vendor Y Vendor X3702MA04_2A Activity Protein Levels 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Percent TNT® Systems Vendor X Vendor Y Protein Levels Activity SP6 Systems T7 Systems ルシフェラーゼタンパク質のウェスタン分析 TNT® Quick System（レーン 1-3）または Vendor Y（レーン 4-6）およ び Vendor X（レーン 7-9）の 2 段階転写翻訳システムの反応液 3µl を ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。 Anti-Luciferase pAb（カタログ番号 G7451）、Donkey Anti-Goat IgG HRP Conjugate（カタログ番号 V8051）を利用した化学発光検出によ り可視化した。レーン 1, 4, 7 は DNA を含まないネガティブコントロー ル反応 ルシフェラーゼ活性およびタンパク質レベルにおける競合品との比較 競合品 X と Y とのルシフェラーゼの相対活性およびタンパク質レベ ルを比較した（TNT® Quick System の値を 100％とした場合）。 7871TA M 123456 7 8 9 10 11 12 M 123456 7 8 9 10 11 12 A. B. 真核生物由来のタンパク質発現 転写 / 翻訳反応は TNT® Quick Coupled Transcription/Translation System ( カタログ番号 L1170) および FluoroTect TM GreenLys tRNA ( カタログ番 号 L5001) (1 µl) を用いて行った。反応後、5µl を分取し、導入されなかっ た FluoroTect TM tRNA を除去するために RNase-ONETM で処理し、SDSPAGE に供した。レーン 1. 蛍光マーカー、レーン 2. ネガティブコントロー ル（No-DNA）、レーン 3-12（下表参照）、レーン 13. ルシフェラーゼ。 無細胞発現でテストした溶解性の低いヒト – タンパク質 レーン タンパク質 ACCN 3 Small muscular protein BC005948 4 Melanoma antigen recognized by T cells (MLANA) BC014423 5 B-cell translocation gene 1 anti-proliferative NM_001731 6 Caspase-6, apoptosis-related cysteine protease BC000305 7 Mitogen-activated protein kinase 14 NM_001315 8 Cytochrome P450, family 3, subfamily A, polypeptide 4 NM_017460 9 Protein kinase C, gamma NM_002739 10 Minichromosome maintenance deficient 5 cell division cycle 46 NM_006739 11 v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2 NM_004448 12 Protein tyrosine phosphatase, receptor-type, Z polypeptide 1 NM_002851 ACCN indicates GenBank® accession number. 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） TNT® 無細胞発現システム（ウサギ網状赤血球） 発現システム TNT® T7 Quick Coupled Transcription/ Translation System 40 回分 L1170 68,000 5 回分 L1171 18,000 TNT® SP6 Quick Coupled Transcription/ Translation System 40 回分 L2080 78,000 5 回分 L2081 20,000 内容： • TNT® Quick Master Mix • SP6 or T7 Luciferase Control DNA • T7 TNT® PCR Enhancer (L1170 only) • Methionine • Luciferase Assay Reagent (L1170, L2080 only) • Nuclease-Free Water (L1170, L2080 only) • Protocol 保存条件：-70℃ プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/tntqck.html TNT® 無細胞発現ガイド 5 昆虫細胞抽出液 TNT® Insect Cell Extract Protein Expression System 最大 75µg/ml のタンパク質を合成、より活性のあるタンパクを発現 TNT® T7 Insect Cell Extract Protein Expression System は、タンパク質の無細胞発現システムで、1 チューブで転写／翻訳を行 う便利、迅速なシステムです。タンパク質合成反応は鋳型 DNA の添加で開始され、手間のかかる in vitro での RNA 合成を行う 必要はありません。抽出液は汎用される Spodoptera frugiperda Sf21 細胞株より調製されています。転写 / 翻訳に必要な全て の成分は TNT® T7 ICE Master Mix に含まれています。反応液に鋳型 DNA を加えて 28–30℃インキュベーションすれば 4 時間 以内にタンパク質合成が完了します。 専用のベクター（pF25A および pF25K）には、翻訳効率を向上させるためにクローニング領域の 5′ および 3′ 末端にバキュロ ウイルス ポリヘドリン遺伝子の非翻訳領域（UTR）配列が含まれており、本システムで最適な収量が得られるようにデザインさ れています。TNT® T7 Insect Cell Extract Protein Expression System およびこれらのベクターを使用することにより 最大 75µg/ ml の機能性タンパク質を調製することができます。 0 10 20 30 40 60 50 80 70 15 20 75 45 Yield (µg/ml) Firefly Luciferase Renilla Luciferase HaloTag® Procaspase-3 Protein 7675MA 7645MB pF25A ICE T7 Flexi® Vector (3947bp) Ampr ori cer SgfI Barnase PmeI 3´ polyhedrin UTR T7 terminator T7 5´ polyhedrin UTR (dA:dT)30 7646MB pF25K ICE T7 Flexi® Vector (3942bp) Kanr ori cer 3´ polyhedrin UTR T7 terminator T7 5´ polyhedrin UTR SgfI PmeI Barnase (dA:dT)30 7671TA M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213 19 26 50 80 125 kD ヒト – プロテインキナーゼの発現 11 種のヒト – キナーゼ遺伝子を pF25A または pF25K T7 ICE Flexi ® Vector にクローニングし、4µg の精製プラスミドを 50µl TNT® 反応に 使用した。FluoroTect TM GreenLys tRNA ( カタログ番号 L5001) (1 µl) を 各反応に添加し、4 時間インキュベーションした。各反応液から 1µl をサンプルバッファーに加え、4-20% トリス – グリシンゲルに添加し た。レーン M, molecular weight markers (Cambrex); レーン 1, pF25Aルシフェラーゼポジティブポジティブコントロール ; レーン 2 から 12 : AURKC, MAPK1, AURKB, PKA, MAPK14, AURKA, SRC, SYK, PKC gamma, AKT, PI3K; レーン 13, DNA なし（ネガティブコントロール）; レーン 14, DNA なし、FluoroTect TM GreenLys tRNA 不含（ネガティブコ ントロール）。 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） TNT® 無細胞発現システム（Sf21 昆虫細胞） 発現システム TNT® T7 Insect Cell Extract Protein Expression System 40 回分 L1102 82,000 10 回分 L1101 23,000 内容： • TNT® T7 ICE Master Mix • Luciferase ICE T7 Control DNA • Nuclease-Free Water • Protocol ベクター pF25A T7 Flexi® Vector 20µg L1061 48,000 pF25K T7 Flexi® Vector 20µg L1081 48,000 保存条件：-70℃（発現システム）、-20℃（ベクター） プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/tntice.html TNT® T7 Insect Cell Extract Protein Expression System で 得られたタンパク質収量 pF25A/K T7 Flexi ® Vector のベクターマップ 6 小麦胚芽抽出液 TNT® SP6 High-Yield Protein Expression System 最大 100µg/ml のタンパク質を合成、可溶性タンパクを発現 TNT® High Yield Protein Expression System は、簡便、迅速にシングルチューブで転写/翻訳のカップリング反応を行うためにデ ザインされており、最大100µg/mlのタンパク質収量が得られます。この無細胞発現システムには最適化された小麦胚芽抽出液 をはじめ鋳型DNAから直接タンパク質を合成するために必要な全ての成分（tRNA、リボゾーム、アミノ酸、ポリメラーゼ、翻 訳開始・伸張・停止因子）が含まれています。このシステムはSP6プロモーターの下流にクローニングされた遺伝子を発現し ます。タンパク質の合成は適切な鋳型DNAの添加で開始しされ、25℃で2時間インキュベーションするだけです。合成タンパ ク質はSDS-PAGEによる分析、あるいはその他様々なアプリケーションにそのまま使用できます。 最大100µg/ml のタンパク質 を発現するようにデザインされていますが、透析システムを利用することにより最大 200-400µg/ml の収量が得られるため、タ ンパク質の機能、構造分析にも利用することが可能です。 pF3A WG（BYDV）およびpF3K WG（BYDV）Flexi ® Vectorは、小麦胚芽抽出液を用いたin vitro発現用にデザインされていま す。オオムギ黄萎ウイルス（BYDV）由来の 5′ および 3′ UTR配列が目的のタンパク質コード領域クローニングサイトの上下流に 配置されています。これらBYDV上下流UTRエレメントの相互作用により閉ループが形成され、mRNAキャッピングやポリアデ ニル化に対する依存性を回避した相乗的な翻訳が促進されます。 4910MA pF3A WG (BYDV) Flexi ® Vector (3,689bp) ori cer Pme I Barnase BYDV 5´ UTR T7 Terminator Ampr Sgf I BYDV 3´ TE T7 rrnB Terminator SP6 7516TA TNT® High-Yield Protein Expression System と大腸菌で発現できた完全 長タンパク質数の比較 ヒト 55 種類のタンパク質で試験した結果、High-Yield Protein Expression System は大腸菌に比べて多くの完全長タンパク質を発現した。 60 50 40 30 20 10 0 Number of expressed full-length proteins E. coli expression TNT ® High-Yield Protein Expression System 55/55 3/55 7513MA TNT® High-Yield Protein Expression System を用いた タンパク質の合成 タンパク質は 8µg プラスミド DNA を用いて透析法を利用して発現 させた。レーン 1. ホタル – ルシフェラーゼ (62kDa)、レーン 2. GFP (28kDa) 、レーン 3. ウミシイタケルシフェラーゼ (36kDa)。 透析法については Promega Notes No. 94 を参照ください。 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） TNT® 無細胞発現システム（小麦胚芽） 発現システム TNT® SP6 High-Yield Protein Expression System 40 回分 L3260 75,000 10 回分 L3261 22,000 内容： • TNT® SP6 High-Yield Master Mix • Nuclease-Free Water • Protocol ベクター pF3A WG (BYDV) Flexi® Vector 20µg L5671 45,000 pF3K WG (BYDV) Flexi® Vector 20µg L5681 45,000 保存条件：-70℃（発現システム）、-20℃（ベクター） プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/tntwghigh.html pF3A WG (BYDV) Flexi ® Vector のベクターマップ TNT® 無細胞発現ガイド 7 大腸菌抽出液 S30 T7 High-Yield Protein Expression System 最大 500µg/ml のタンパク質を合成 E. coli S30 T7 High-Yield Protein Expression Systemは、T7プロモーターおよびリボゾーム結合サイト (RBS) を含むベクターから 約1～数時間以内に最大500µg/mlのタンパク質を発現するようにデザインされています。システムに付属する抽出液にはT7 RNA ポリメラーゼが含まれており、OmpTエンドプロテイナーゼやIonプロテアーゼ活性が欠失しています。 また、システムに含まれ るその他の必要な試薬はタンパク質の翻訳に最適化されています。これにより、標的タンパク質の安定性が向上し、発現レベル が増加します。発現タンパク質は Coomassie® 染色や 蛍光/ビオチン修飾 tRNAの導入により検出することができます。 7637TA 100 75 50 35 25 15 kDa 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 A. B. C. BCCP 環状 DNA からのタンパク質発現 タンパク質コード領域をクローニングした pFN6A (HQ) Flexi ® Vector および FluoroTect TM または TranscendTM tRNA を用いて S30 T7 HighYield Protein Expression System でタンパク質を発現させ、SDS-PAGE で分離後、Coomassie® blue 染色 ( パネル A)、蛍光スキャニング ( パネル B) あるいは PVDF 膜に転写した後、Streptavidin Alkaline Phosphatase ( カタログ番号 V5591) で処理し、Western Blue® Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase ( カタログ番号 S3841; パネル C) で検出した。レーン 1, DNA なし ; レーン 2, ウミシイタケルシフェラー ゼ ; レーン 3, Monster Green® 蛍光タンパク質 ; レーン 4, HaloTag® タンパク質 ; レーン 5, β – ガラクトシダーゼ (BCCP = E. coli biotin carboxyl carrier protein)。 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） TNT® 無細胞発現システム（大腸菌） 発現システム S30 T7 High-Yield Protein Expression System 24 回分 L1110 65,000 8 回分 L1115 25,000 内容： • T7 S30 Extract, Circular • S30 Premix Plus • S30 T7 Control DNA • Nuclease-Free Water • Protocol 保存条件：-70℃ プロメガ資料：www.promega.co.jp/lit/s30t7hy.html S30 T7 HighYield System による GFP の発現 1ml 反応液に 20µl の 鋳型 DNA (pFN6A-MonsterGreen® GFP) をセッ トし、各タイムポイントごとに 50µl を分取した。各反応液は、それ ぞれの表示時間が経過した後反応を停止させるために -20℃で保存 し、全ての反応時間が経過した時点で蛍光を観察した。 7636MA T7 S30 Extract, Circular S30 Premix Plus Circular DNA template with T7 promoter Incubate at 37°C for 1 hour with vigorous shaking. Detect target protein. T7 terminator T7 Protein of interest RBS S30 T7 HighYield System の操作概要 Reaction time (hrs) 1 2 4 6 8 22 テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982 ● E-Mail : prometec@jp.promega.com 日本語 Web site：www.promega.co.jp プロメガ株式会社 本 社 〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982 大阪事務所 〒532-0011 大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室 Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052 ※製品の仕様、価格については2008年12月現在のものであり予告なしに変更することがあります。 PK0812-02 販売店： 無細胞発現関連ツール 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 発現用ヒト -ORF クローン HaloTag® N 末端融合ヒト – タンパク質発現クローン Flexi® HaloTag® Type 1 クローン FHCxxxxx 50,000 pFN21A をベースとしたヒト ORF クローンで T7 プロモーターを含むた め真核生物由来の無細胞発現系にもそのままご利用いただけます。 ヒト – タンパク質発現クローン（タグ無し） Flexi® Cloning Type 1 クローン FXCxxxxx 30,000 pF1K をベースとしたヒト ORF クローンで T7 プロモーターおよび RBS を含むため原核生物由来の無細胞発現系にそのままご利用いただけます。 無細胞発現用ヒト -ORF クローンの詳細、オンライン注文については www.promega.co.jp/flexiclone/ をご覧下さい。 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） 発現用ベクター HaloTag® N 末端融合 pFN19A (HaloTag® 7) T7 SP6 Flexi® Vector 20µg G1891 48,000 pFN19K (HaloTag® 7) T7 SP6 Flexi® Vector 20µg G1841 48,000 HaloTag® C 末端融合 pFC20A (HaloTag® 7) T7 SP6 Flexi® Vector 20µg G1681 48,000 pFC20K (HaloTag® 7) T7 SP6 Flexi® Vector 20µg G1691 48,000 HQ タグ N 末端融合 pFN6A (HQ) Flexi® Vector 20µg C8511 45,000 pFN6K (HQ) Flexi® Vector 20µg C8521 45,000 HQ タグ C 末端融合 pFC7A (HQ) Flexi® Vector 20µg C8531 45,000 pFC7K (HQ) Flexi® Vector 20µg C8541 45,000 GST タグ N 末端融合 pFN2A (GST) Flexi® Vector 20µg C8461 45,000 pFN2K (GST) Flexi® Vector 20µg C8471 45,000 タグ なし pF1A T7 Flexi® Vector 20µg C8441 42,000 pF1K T7 Flexi® Vector 20µg C8451 42,000 ※上記 Flexi ® Vector についての詳細は www.promega.co.jp/flexicloning/ をご覧下さい。 ※ HaloTag® は新規なリガントと特異的に結合する受け皿タンパク質。 蛍光リガンド、ビオチンリガンドなどを用いて細胞内イメージング、 タンパク質間相互作用実験に使用（www.promega.co.jp/halotag/） ※ HQ タグは His タグに変わる金属結合タグで低濃度イミダゾールでの 溶出が可能 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） タンパク質の標識 蛍光検出（タグ – タンパク質） HaloTag® TMR Ligand 15µl G8252 45,000 30µl G8251 75,000 HaloTag® AlexaFluor® 488 Ligand 15µl G1002 45,000 30µl G1001 75,000 ※その他の蛍光リガンドについてはお問い合せ下さい。 蛍光検出 FluoroTectTM GreenLys in vitro Translation Labeling System 40 回分 L5001 50,000 化学発光検出 TranscendTM Chemiluminescent Non-Radioactive Translation Detection System 30 回分 L5080 43,000 発色検出 TranscendTM Colorimetric Non-Radioactive Translation Detection System 30 回分 L5070 30,000 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） タンパク質の捕捉 / 固定 HaloTag® 融合タンパク質の捕捉 HaloLinkTM Magnetic Beads 1ml G9311 16,000 HaloLinkTM Resin 2ml G1911 27,000 5ml G1912 58,000 GST 融合タンパク質の捕捉 MagneGSTTM Particles 4ml V8611 18,000 20ml V8612 65,000 His/HQ 融合タンパク質の捕捉 HisLinkTM Protein Purification Resin 50ml V8821 44,000 5ml V8823 5,000 MagneHisTM Ni-Particles 2ml V8560 19,000 10ml V8565 65,000 製品名 サイズ カタログ番号 価格（￥） タンパク質のプロセシング ミクロゾームメンブレン Canine Pancreatic Microsomal Membranes 50µl Y4041 39,000 Templates, Labeling, Processing 発現実験のリソースから検出までをサポート 無細胞発現系に使用できる鋳型としてヒトORFが組込まれたクローンや発現ベクター、標識アミノ酸、タンパク質修飾研究に 利用できるミクロゾームメンブレンもご利用いただけます。