ＴＮＴ Quick Coupled Transcription/Translation System

ＴＮＴâ Quick Coupled Transcription/Translation System カタログ番号 L1170/L1171/L2080/L2081 ※この説明書は簡易型の⽇本語マニュアルです。詳細については Technical Manual No.045をご覧ください。 もくじ A. 使⽤前の注意点 B. 鋳型DNAについての注意点 C. ＴＮＴR Quickによるin vitro転写／翻訳反応 D. ルシフェラーゼコントロール E. RI標識導⼊率計測法 使⽤前の注意点 RNaseの混⼊に注意してください Master Mixは使⽤時には4℃または氷上で取り扱い、使⽤後はすぐに-70℃に保存してください。 ３回以上の凍結／融解を避けてください。 鋳型DNAについての注意点 1．純度 ⼤腸菌からのプラスミド精製の場合、通常のアルカリ-SDS法またはWizard Minipreps DNA Purification Systemで⼗分な純度が 得られます。 PCR産物はそのまま、またはWizard PCR Preps DNA Purification Systemまたはエタノール沈殿／洗浄して使⽤できます。 制限酵素で消化したDNAの場合、フェノール／クロロホルム抽出＋エタノール沈殿処理またはWizard PCR Preps DNA Purification Systemで不純物を除いて下さい。 鋳型DNAに含まれるエタノールは完全に除いてください。 2．コンストラクト 5’-untranslated region（UTR）の強いヘアピン構造は除いて下さい。 ポリA配列を付けると翻訳効率が上がります（ルシフェラーゼの場合 2〜5倍増加）。 ▲ 直鎖状DNAの場合 プロモーター上流に20bp程度のDNAの遊びが必要です。 リボゾームが停滞するのを防ぐためにストップコドン（UAA）が必要です。 SP6 Systemでは転写効率が落ちるため直鎖状DNAを鋳型にするのことはお勧めしません。 3’突出末端を持つ鋳型DNAは異常な翻訳産物合成の原因となります。 ＴＮＴ® Quickによるin vitro転写／翻訳 反応 1. 反応液調製 Ａ反応 →RI標識の場合 B反応 →Non-RI標識の場合（Transcend™ tRNA使⽤ ［カタログ番号 L5070または L5080 ］） C反応 →翻訳後修飾の場合 （Canine Pancreatic Microsomal Membranes 使⽤ ［カタログ番号 Y4041 ］） ® ® ® ※In vitro転写/翻訳反応に上記ミクロゾームメンブレンを加えることにより、翻訳後修飾（シグナルペプチドの切断、グリコシレーションなど）の実験を⾏えま す。 TNT 反応ミックス A反応 B反応 C反応 [ Ｓ]メチオニン 標識の場合 Transcend™ tRNA標識の場合 翻訳後修飾（+CPMM） ＴＮＴR Quick Master Mix 40μl 40μl 20μl メチオニン、1mM － 1μl － ［ Ｓ］メチオニン （1,000Ci/mmolで10mCi/ml） 2μl － 2μl 鋳型ＤＮＡ 2μl (1μg) 2μl (1μg) 2μl (0.5μg) Transcend™Biotin-Lysyl-tRNA － 1μl Canine Pancreatic Microsomal Membranes － － 0.3〜2.5μl Nuclease-Free Waterで右の量までメスアップ 50μl 50μl 25μl 1. ＴＮＴ Quick Master Mixは発現レベルを最⼤限引き出すために最適化していますが、特種な遺伝⼦の場合Mg （酢酸マグネ シウム0.1〜0.6mM）、K （塩化カリウム10〜50mM）の最適化が必要な場合があります。 Master Mixに含まれる内因性タ ンパク質は100〜200mg/ml程度です。 2. アマシャム社のRedivue L-[ S]メチオニン（カタログ番号 AG1094）をお勧めします。この製品の使⽤で、ウサギ網状⾚⾎球 抽出液由来の42kDaのバックグラウンドが抑えられ、安定剤も含まれています。通常の[ S]標識アミノ酸は不安定で、その酸 化物は翻訳を阻害します。 3. プラスミドDNAの場合0.2〜2.0μg、PCR産物の場合100〜800ngの使⽤をお勧めします。 4. リジン含量の低いタンパク質または発現レベルが低い場合Transcend™ tRNAを増やして（1〜4μl）感度を上げることができま す。 5. 反応にカルシウムを加えないで下さい。 6. 添加するミクロゾームメンブレンの量は最適化を必要とします。通常、ミクロゾームメンブレン量を増やすと、修飾の割合は 増えますが、ポリペプチド合成量⾃体が減少します。 7. 添加するミクロゾームメンブレンの量は最適化を必要とします。通常、ミクロゾームメンブレン量を増やすと、修飾の割合は 増えますが、ポリペプチド合成量⾃体が減少します 8. SP6システムの場合、ミクロゾームメンブレンの添加により翻訳が阻害される傾向にあるため1.8μl以上添加しないでくださ い。0.6μlのミクロゾームメンブレンで翻訳が約50％阻害されます。 2. 30℃で60-90分インキュベート ＊ 時間を短縮したい場合、37℃、30分でも可能ですが、⾮常に低分⼦量の翻訳産物ができることがあります。 3. 解析 SDS-PAGE ルシフェラーゼコントロール ルシフェラーゼは61kDaの単量体で、完全⻑のタンパク質が活性を持ち、活性化には翻訳後修飾も必要ないので、本システムのポ ジティブコントロールに最適です。 1. RIによる検出 35 1) 35 2) 3) 4) 6) 7) 5) ® 2+ + 35 35 1. 上記ＴＮＴ Quick反応Aと同様（鋳型DNAとしてLuciferase Control DNAを使⽤） 2. SDS-PAGE またはRI標識導⼊率の計測 （翻訳産物は-20℃で2ヶ⽉、 -70℃で6ヶ⽉保存可能） 2.Non-RIによる検出 （ルシフェラーゼ活性測定） 1. 上記ＴＮＴ Quick反応BからTranscend™ tRNAを除いた反応（鋳型DNAとしてLuciferase Control DNAを使⽤） 2. ルミノメーター／シンチレーションカウンターによる検出 50μlのLuciferase Assay Reagentに2.5μlのＴＮＴ Quick反応液を加え、検出機器で測光する。 RI標識導⼊率計測法 1. 50μl翻訳反応液から2μlを98μl の1M NaOH/2%H O に混合 2. ボルテックス後、37℃で10分間インキュベート 3. 翻訳産物を沈殿させるために、氷冷した25%TCA/2%カザミノ酸 900μlを加え、氷上で30分間インキュベート 4. Whatman GF/Cグラスファイバーフィルターを少量の氷冷5%TCAで濡らし、３）のTCA反応混合液250μlを吸引により濾過 し、翻訳産物の沈殿を回収。フィルターを1〜3mlの氷冷5%TCAで3回洗浄。1〜3mlのアセトンで1回洗浄。その後、フィルタ ーは、室温または、ヒートランプで少なくとも10分間乾燥 5. フィルターを1〜3mlのシンチレーション混合液に⼊れ、転倒攪拌後、液体シンチレーションカウンターで計測 6. 転写／翻訳反応液のトータルカウント数を計測するために、5μlのTCA反応混合液をフィルターに直接スポットし、５）の様 に計測 7. バックグラウンドカウントを計測するために、鋳型DNAを⼊れなかった50μl 転写／翻訳反応から2μlをステップ１）〜５）に 従って処理 8. RI標識導⼊率計算 洗浄したフィルター（ステップ5）のcpm Ｘ100 未洗浄のフィルター（ステップ6）のcpm Ｘ 50 ＝ ％ 導⼊率 9. バックグラウンドに対するfold stimulation計算 洗浄したフィルター（ステップ5）のcpm 鋳型DNAなし反応液からの洗浄フィルター（ステップ７）のcpm ＝ fold stimulation ® ® ® 2 2 ®