Wizard® SV Genomic DNA Purification System

Revised 2/02 Part #9FB069J TECHNICAL INFORMATION: www.promega.co.jp • Tel 03-3669-7980 • Fax 03-3669-7982 Wizard® SV Genomic DNA Purification System INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCTS A2360 AND A2361. Quick PROTOCOL3643MA02_2A 遠心 spin columnを1.5ml 遠心チューブに移し、 遠心 1X PBSで 培養細胞を洗浄 Wizard® SV Lysis Buffer添加 Wizard® SV Lysis Buffer添加 ライセート ゲノムＤNAの溶出 Miniprep Vacuum Adapter (カタログ番号 A1331)* Vac-Man® Laboratory Vacuum Manifold (カタログ番号 A7231)* マウス尾 または組織 培養細胞 プロティナーゼ K 処理 (16–18 時間) ＤNA 結合 吸引法 遠心による洗浄 および溶液の除去 吸引による洗浄 および溶液の除去 遠心法 Additional protocol information is available in Technical Bulletin #TB302, available upon request from Promega or online at www.promega.com 吸引法プロトコル（マウス尾/動物組織：遠心法でも可能） サンプル調製 1. マウス尾を 0.5～1.2cm の長さに切断、または組織サンプル＜20mg を 秤量。マウス尾または組織サンプルをさらに2つに切断し、1.5ml マイ クロ遠心チューブに入れる。 2. Digestion Solution Master Mix 275µl を各チューブに添加。 3. サンプルチューブを一晩 (16～18 時間) 55℃ のヒートブロックでインキ ュベート。 4. Wizard® SV Lysis Buffer 250µl を各サンプルに添加し、ボルテックス。 5. Lysis Buffer添加後はできるだけ迅速にライセートを調製。-70℃で凍結 させている場合、ライセートは次の操作の前に55℃、1時間 融解/加熱 （ライセートは操作前に温めておく必要がある）。 Vac-Man® Vacuum Manifoldを用いたゲノムDNAの精製 6. 各ライセートごとにWizard® SV Minicolumn1つを使用。マニホールド のポートに取り付けられたLuer-Lok®にMiniprep Vacuum Adapter を装着。静かにSV RNA Spin Basket をvacuum adapter に挿入し、 マニホールドの未使用のポートが閉じていることを確認。 7. 調製したサンプルライセートをWizard® SV Minicolumnに移す。 8. ライセートがminicolumnを通過するまで吸引し、その後Luer-Lok® stopcockを閉じる。 9. Wizard SV® Wash Solution (95% エタノール添加済み) 800µlをminicolumnに添加。溶液がcolumnを通過するまで吸引し、その後ポートを 閉じる。 この洗浄操作を計4 回繰り返す。 10. 各ポートを開き、メンブレンを乾燥させるために4分間吸引。 11. ポートを閉じ、吸引源を止め、陰圧を開放。 12. Wizard® SV Minicolumnを新しい1.5ml チューブに移す。室温の Nuclease-Free Water 250µl をminicolumn添加し、2 分間室温でインキ ュベート。 13. minicolumnを装着したチューブを13,000 × g、1分間遠心。ステップ 12-13の溶出操作を 計2回行う (溶出液500µl )。 14. minicolumnは廃棄し、精製したDNAは-20～ -70℃で保存。 遠心法プロトコル（組織培養細胞：吸引法でも可能） サンプル調製 1. 1 × 104 個（最少）～5 ×106 個（最高）の細胞を1X PBSで1回洗浄 2. Wizard® SV Lysis Buffer 150µl を、洗浄したプレート中の細胞に添加し、 ピペッティングによりこのライセートを混和。 3. このライセートを直ぐに使用しない場合、使用時まで-70℃で凍結保存 可能。 遠心による培養細胞ライセートからのゲノムDNA精製 4. プレート中の各サンプルライセートをWizard® SV Minicolumn Assembly に移す。 5. Assemblyを13,000 × g、3 分間遠心。 6. Assemblyからminicolumnを外し、Collection Tube内の液体を除去。 7. Wizard® SV Wash Solution (95% エタノール添加済み) 650 µl各 assemblyに添加。13,000 × g、1分間遠心し、 Collection Tube内の液体を除 去。この洗浄操作を4回繰り返す。 8. Collection Tube内の液体を除去し、 再びminicolumnをCollection Tube に挿入。13,000 × g、2分間遠心し、メンブレンを乾燥。 9. Wizard® SV Minicolumnを新しい1.5ml tubeに移し、室温のNucleaseFree Water 250 µlを添加。室温で2分間インキュベート。 10. minicolumn/elution tube assembly を13,000 × g、1分間遠心（ 溶出量 は約250 µl）。 11.minicolumnを廃棄し、 精製したDNA は-20℃または-70℃で保存。 Digestion Solution Master Mix Volume per Sample Nuclei Lysis Buffer 200µl 0.5M EDTA (pH 8.0) 50µl proteinase K, 20mg/ml 20µl RNase A Solution, 4mg/ml 5µl Total Volume 275µl