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Flexi® Vector System

Flexi® Vector Systemの使用方法を簡単に説明してください。

目的遺伝子を初めてFlexi^® Vectorに導入する場合（エントリー）と目的遺伝子を他のFlexi^® Vectorに組み換える場合（トランスファー）について説明します。詳細は製品プロトコールTM254をご参照ください。

1) 目的遺伝子を初めてFlexi^® Vectorに導入する（エントリー）

Sgf Iと Pme Iを含むプライマーを用いて目的遺伝子をPCRで増幅し、実験に適したFlexi^® Vectorにクローニングします。

<ステップ1；プライマーの設計とPCR>
Flexi^® Vector Primer Design Toolを用いて、Sgf IおよびPmeIサイトを含むプライマーを設計します。このプライマーを用いてPCRを行い、目的遺伝子を増幅します(図3)。

<ステップ2；クローニング>
PCR産物は、Wizard^® SV Gel and PCR Clean-Up System で精製します。次に、Flexi^® Enzyme Blend (Sgf I and Pme I)を用いて、PCR産物とFlexi^® Vectorをそれぞれ切断し、PCR産物をWizard^® SV Gel and PCR Clean-Up System で精製します*）。その後、ライゲーション、トランスフォーメーションを行います。ベクターに含まれる致死遺伝子(lethal gene；Barnase)をもつクローンは生育できないため、目的遺伝子を含むクローンのみが得られます。また、培地には、必ずアンピシリンもしくはカナマイシンを添加し、薬剤スクリーニングも実施してください。

*）一般的なクローニングでは、制限酵素処理したベクターから切り出されたDNA断片を除くためにベクターの精製を行う場合もありますが、Flexi^® Vectorでは、Sgf I とPme Iの処理で致死遺伝子が切り出され、それを含むクローンは生育できないため、ベクターの精製は不要です 。

2) 目的遺伝子を他のFlexi^® Vectorに組み換える（トランスファー）

目的遺伝子をクローニングしたベクター（Donor）から他の機能を有するFlexi^® Vector（Acceptor）に組み換える場合*）、これら2種類のベクターを同時にFlexi^® Enzyme Blend (Sgf I and Pme I)で切断します。引き続き、精製操作を行うことなく、ライゲーション、トランスフォーメーションを行います。Acceptorとなるベクターがもつ薬剤耐性(Amp^rあるいはKan^r)と致死遺伝子(lethal gene)による選択により、目的クローンを高効率に得ることができます(図5)。

* ）Acceptor にはDonorと異なる薬剤耐性マーカーをもつベクターを選択してください。