• Q&Aトップ
• クローニング
• 酵素_制限酵素
• 制限酵素基本情報

制限酵素基本情報

制限酵素反応とは?

制限酵素反応による解析には、通常20μl反応液に約0.2～1.5μg の基質DNAに対して2～10倍の過剰量の酵素(μg DNAあたり2～10ユニット)を加えて行います。DNAと酵素の容量はあるレベルを超えない範囲で行ってください。例えば、反応液の10%以上がDNAサンプルにならないようにしてください。DNAサンプルに制限酵素反応を阻害する物質(EDTAなど)が含まれている可能性があるためです。そのため、プロメガでは20μl反応液あたり 2μl以下のDNAを使うことを推奨します。また、最終的なグリセロール濃度は5%以下が望ましいので、酵素量は反応液の10%またはそれ以下の量にすることを推奨します。グリセロール濃度が高い場合、酵素群によってはStar活性(通常の認識部位と同一ではなく類似した配列を消化する)を生じることがあります。

以下に典型的な制限酵素反応の例を示します。各試薬は以下に示された順で滅菌した微量遠心チューブに加えてください。

滅菌済みNuclease-Free Water	14μl
適切な制限酵素の10Xバッファー(例えば、Buffer E)	2μl
アセチル化BSA(1mg/ml)*	2μl
DNAサンプル(0.2-1μg) in D.W.またはTEバッファー	1μl
制限酵素(10u/μl) (例えば、BamH I)	1μl
最終容量	20μl

*プロメガの制限酵素には10mg/mlのアセチル化BSAが添付されています。これを使用前にNuclease-Free Waterで10倍希釈してください。もしくは、10mg/mlのアセチル化BSA(原液)を100倍希釈になるように制限酵素反応液に直接加えてください。

ピペッティングで穏やかに混ぜ(酵素を加えた後にボルテックスは行わないでください)、12,000×gで短時間の遠心を行い、混合液をチューブの底におとします。最適反応温度で1~4時間インキュベートします(ほとんどの制限酵素の最適反応温度は37℃ですが、ある程度の幅を持たせることができます)。4μlのBlue/Orange Loading Dye, 6Xを加え、電気泳動により解析します。

制限酵素バッファーの組成については下記pdf ファイル(Composition of Promega Restriction Enzyme Buffers [1X])をご覧ください。各酵素ごと反応温度での4-CORE Bufferを使った制限酵素の相対的な活性については制限酵素関連情報の表（page 18.16-17）(Relative Activity of Restriction Enzymes in Promega's 10X Buffers)をご覧ください。(eNotes-FAQ0001)

制限酵素バッファー組成（pdfファイル）

制限酵素関連情報（pdfファイル）