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Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIAP)

仔ウシ腸管粘膜由来アルカリホスファターゼ(CIAP) は、脱リン酸化反応の後どのようにしたら不活性化できますか。

仔ウシ腸間膜アルカリホスファターゼ(CIAP) は、サブクローニングのときに分子の末端からリン酸基を除去するためによく用いられます。この酵素は完全に不活性化するのが難しいため、酵素を過剰に加えないようにすることが重要です。酵素の比活性が高いため(1pmolのDNA末端を、脱リン酸化するのに0.01unitで十分です、ライゲーション反応へのCIAPの持ち込みは反応が大きく妨げられることがあります。
この酵素を不活性化する方法として主要な３つの方法を以下に例示します。

• 第1の方法では、CIAPはEDTA(5mM)、SDS(0.5%)、およびproteinase K (50ug/ml) (最終濃度)を加えることにより消化できます。この消化は、56℃で30分間処理した後、70℃で10-15分間インキュベートすることで不活性化できます。
• 第２の方法では、EDTAを最終濃度5mMとなるように加え、反応液を75℃で10分間インキュベートします。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールによる抽出を続いて行うことで、CIAPは物理的に除去されます。
• 第３の方法では、6×のCIAP stop buffer (10mM Tris-HCl (pH 7.5), 1mM EDTA, 200mM NaCl and 0.5% SDS) を脱リン酸化反応に加え、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出とそれに続くエタノール沈殿により脱リン酸化されたDNAを抽出します。（eNote-FAQ)