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Caspase-Glo® Assay（発光検出）

アポトーシスが誘導されていない細胞（Background）で測定値が高くなってしまいました。どのような原因が考えられますか？

Caspase-Glo® Assayは感度の高い製品ですので、少ない細胞数でもCaspaseを検出することができます。アポトーシスが誘導されていない細胞で測定値が高くなってしまう要因は、以下の2点について考えられます。

1) wellあたりに含まれる細胞数が多く、コンフルエントな状態になっている
2) 培地成分にLuciferaseの反応に影響する物質が含まれている。
このような場合は、刺激を加えていない細胞（Background）とアポトーシスを確実に誘導できる物質で処理した細胞（Positive control；実験系は表1をご参照ください）で確認いただいてから、測定・比較をしてください（図1）。

図1　Jurkat cells をanti-Fas mAb で 4.5 時間処理し、アポトーシスを誘導させました。その後、Caspase-Glo® 3/7試薬を添加し、1時間後にルミノメーターで測定しました。 96 well plateでの反応容量は200μLです（うち、添加したCaspase-Glo®試薬は100μLです）。

表1　アポトーシス誘導の条件

Caspase	細胞種	アポトーシス誘導物質	濃度（終濃度）	誘導時間
Caspase-3/7	Jurkat （10,000 cells/well）	Anti-Fas 抗体	100-200ng/mL	4-5 時間
Caspase-3/7		Staurosporine	500-1000nM	4-5時間
Caspase-3/7	HeLa （10,000 cells/well）	Staurosporine	1000nM	5 時間
Caspase-3/7	MCF-7 (25,000 cells/well)	Staurosporine	5μM	5 時間
Caspase-3/7	Rat Primary Striatal Neural Culture（25,000 cells/well）	Staurosporine	3-5μM	5 時間
Caspase-3/7	HepG2 variant （40,000 cells/well）	Staurosporine	500-1000nM	24 時間
Caspase-3/7	PC 12 （10,000-20,000 cells /well）	Staurosporine	10μM	5時間～10時間
Caspase-8	Jurkat （10,000-50,000 cells /well）	Anti-Fas 抗体	100 ng/mL	3時間
Caspase-9	HL-60 （10,000-50,000 cells /well）	Vinblastine	50μM	3時間
Caspase-8, 9	HeLa （25,000 cells /well）	Staurosporine	50μM	0～5時間処理し、30分間隔でアッセイを行った結果、2.5時間 から活性が検出され、4.5時間で最大活性が認められます。