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DeadEnd™System

DeadEnd™ Colorimetric Apoptosis Detection Systemを使うときに最適化するのが必要なポイントは何ですか。

DeadEnd™ Systemを使ってアポトーシスを解析する時にキーとなる要因は細胞や組織を浸透化するための方法です。チャンバースライドやpoly-L-lysineでコートしたスライドの上で培養された細胞では、10% buffered formalinや4% paraformaldehydeの迅速な固定化に続く、0.2% Triton X-100の浸透化が一般的に適当です。しかし組織ではより厳密な方法が要求されます。DeadEnd™ Systemは、組織の浸透化のためにProteinase Kを添付しています。組織の切片は、20μg/ml Proteinase Kで10～30分間室温で処理します。一般的に薄い切片（例えば5～10umのパラフィン切片）では短いインキュベーション時間で十分です。一方、厚い切片（例えば50μmのビブラトーム切片）では長い時間が必要となります。しかし、長時間のインキュベーションによってスライドから組織切片がはがれる可能性があります。

アポトーシスの誘導物質や実験の条件を設定するための予備実験では、陽性コントロール実験が必須です。陽性コントロールを準備するために、細胞や組織切片を浸透化した後、DNaseIをスライドに加えます。断片化されたゲノムDNAは、TdTによってラベルされます。この陽性コントロールのプロトコールはDeadEnd™ Systemに添付される取扱説明書（Technical Bulletin）に記載されています（1）。標準的な試験で、アポトーシスを誘導すると推定される因子で処理した細胞が標識されず、陽性コントロールが陽性だった（標識された）場合、キット自体は正しく機能しており、全ての予測される可能性において、テストされている因子はこれらの条件下でDNAの断片化を誘導していないことになります（を示しています）。（PN72-Q&A)

参考文献：
  1. DeadEnd™ Colorimetric Apoptosis Detection System Technical Bulletin #TB199, Promega Corporation.