• Q&Aトップ
• クローニング
• クローニング_クローニングベクター
• pGEM®-T Vector Systems ・ pGEM®-T Easy Vector Systems

pGEM®-T Vector Systems ・ pGEM®-T Easy Vector Systems

どのような要因がライゲーション効率に影響しますか?

塩類、dNTPs、プライマー、耐熱性酵素のような一般的なPCR反応液に含まれる成分はライゲーション効率にマイナス要因となります。そのため、ライゲーション前に、これらの成分をプロメガのWizard^® PCR Preps DNA Purification System^(e)、サイズ除去クロマトグラフィー、その他の方法(1)を用いて除くことにより効率は上がると考えられます。

目的のPCR産物と同様にプライマーダイマーや非特異的に増幅された産物も3’末端にAの突出を含んでいるので、T-Vectorにライゲーションされます。これらの余分な産物を除くことで目的のインサートを含んだ白いコロニーの出現確率を上げることができます。

どのようなライゲーション反応でも最終的にはベクターとインサートDNAのモル比を変えて最適化を行います。通常ではインサートとベクターのモル比を1:3、1:1、3:1の3種類で行い、最適化されたライゲーション効率をテストします。まれにinsert:vectorのモル比10:1までのテストが必要な場合があります。（PN68-Q&A)

参考文献：
1.Frohman, M.A. (1994) In: The Polymerase Chain Reaction, Mullis, K.B., Ferr・ F. and Gibbs, R.A., eds. Birh舫ser Boston, Cambridge, MA