• Q&Aトップ
• レポーターアッセイ＆シグナリング
• 細胞内シグナリング_キナーゼアッセイ
• Kinase-Glo®

Kinase-Glo®

IC50の算出方法を教えてください。

IC50値の測定方法として、プロメガでの実施例を以下に紹介します。
PKA (Cat.# V5161) と5μM Kemptide substrate (Cat.# V5601) を50μL のkinase reaction buffer (40mM Tris [pH 7.5],20mM MgCl₂, 0.1mg/mL BSA) で希釈し、ATP濃度を1μMに固定します。キナーゼ反応は、20分間、室温で実施しました。さらに、キナーゼ反応液中に阻害剤 (Ｈ-8またはH-9) を添加しました。

阻害剤（H-8または、H-9）の濃度を変化させたときのRLU値のプロットを図4に示します。IC₅₀値は、RLU値の中間値の対数値濃度から算出します。曲線近似は、GraphPad Prism^®シグモイド用量反応曲線(可変勾配) 用ソフトウェアを用いて行いました。

図4 Aは、阻害剤としてH-8を使用した場合のグラフです。プロットから、Log₁₀IC₅₀=0.56より、IC₅₀=3.7μMとなります。図4 Bは、阻害剤としてH-9を使用したときのもので、Log₁₀IC₅₀=0.38、IC₅₀=2.4μMとなります。論文(1)で報告されているIC₅₀値は、H-8では、IC₅₀=1.2μM、H-9ではIC₅₀=1.9μMとなり、Kinase-Glo^® を用いて算出した値はこれらに近い値を示しています。

IC50の決定については製品プロトコルの "Determining IC50 Values of Kinase Inhibitors" の項目もあわせてご参照ください。

参考文献(1):
Hidaka, H., Watanabe, M. and Kobayashi, K. (1991) Properties and use of Hseriescompounds as protein kinase inhibitors. Methods in Enzymology, 201,328-339.