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Kinase-Glo®

培養細胞抽出液中のキナーゼ活性を測定できますか？

培養細胞に存在するキナーゼの活性をKinase-Glo^® で測定することも可能です。ただし、細胞には多種類のキナーゼが含まれるため一般医バックグラウンドが高く、またATP変化が標的キナーゼに由来するかどうか慎重に検討する必要があります。
実施事例としてU937細胞に含まれるPKC(Protein Kinase C）の活性をKinase-Gloを用いて測定した論文^（3）があります。
標的キナーゼ活性の低いコントロールの細胞と標的キナーゼ活性の高いサンプルの細胞を使用して、キナーゼ反応後のATP量を比較しています。
論文中の細胞抽出方法は、以下のとおりです。

①U937 cells を1 x 10⁷個となるように培養します。
②LPSを5μg/mLとなるように培地に添加し、37℃、4 時間インキュベートします。
③ 冷却したPBSで細胞を洗浄後、200 uLのkinase reaction buffer (40 mM Tris, pH 7.5, 20 mM MgCl₂, 0.1 mg/mL BSA)を添加し、超音波で細胞を破砕します。
④ サンプルを50uLのPKC 反応buffer (20 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 0.1 mg/mL BSA, 250 μM EGTA, 400 μM CaCl₂, 0.32 mg/ml phosphatidylserine, 0.032 mg/mL diacylglycerol)で希釈し、10 μM のATP と100 μMの neurogranin_(28-43) を添加し、90分間室温でインキュベートします。
⑤50μLのKinase-Glo^® 試薬を添加し、10分間室温でインキュベートしたのち、ルミノメーターで測定します。

参考文献(3):
Roman　J. et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 287: 287-249(2004)