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TNT® System

鋳型DNAはどのように調製すればよいですか？

鋳型DNAは、環状DNA (Plasmid DNA)または直鎖 DNA (DNA fragment、PCR産物)を調製します。

1) 環状 DNA を使用する場合

• pTNT^® Vector(L5610)または、pCMVTNT^® Vector(L5620)のマルチクローニングサイトに遺伝子配列を挿入することができます。この場合は、開始コドン(ATG)を遺伝子配列に入れてください。
• pTNT^® Vector, pCMVTNT^® Vector以外のVectorを使用する場合は、TNT Systemで使用するプロモーター配列、開始コドン、終止コドン、T7 terminator配列（必要に応じて）をご確認ください。

注意：pTNT^® Vector、pCMVTNT^® Vectorには翻訳効率を上げるためにβ-グロビン5’-リーダーシークエンス配列を含んでいます。鋳型DNAの配列によっては、転写・翻訳反応の効率が低いい場合もあります。使用するテストサンプルと同時にシステムに付属のControl反応を実施してください。

2) 直鎖DNAを使用する場合

• 環状DNAを制限酵素で切断し、直鎖DNAにする場合
  →平滑末端で切断できる制限酵素を使用してください。突出末端で切断した場合は、Klenow Fragmentなどで平滑末端処理をしてください。
• PCRにより鋳型DNAを調製する場合（TNT^® Quick for PCR DNA）
  →forward primerとしてT7 promoter配列+スペーサー配列+Kozakの配列を含むように設計します（表5）。

表5　TNT^® Quick for PCR DNAで用いられたT7プロモーターの配列

制限酵素サイト	T7 Bacteriophage Sequence	Spacer	Eukaryotic Translation Initiation Sequence	参考文献
GGATCC	TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG	AG	CCC ACC ATG	5,6
GGATCC	TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG	AG	CCC ACC ATG G	7,8
GGATCC	TAA TAC GAC TCA CTA TAG G	AA CAG	CCC ACC ATGG	9,10
nnn	TAA TAC GAC TCA CTA TAG G	AA CAG	CCC ACC ATG	11,12

3) TNT^® System反応に用いる鋳型DNAの精製方法

環状DNAは、Wizard^® Plus SV Minipreps (A1330など)を用いて精製することを推奨しています。直鎖DNAは、Wizard^® SV Gel and PCR Clean-Up System (A9281)で精製することを推奨しています。

精製後のDNAは、OD_260nm/OD_280nmを測定し、ratio=1.8以上となるようにしてください。ratio=1.8以下の場合は、エタノール沈殿を実施してください。ratioが1.8よりも小さい鋳型DNAを使用した場合、転写・翻訳の効率は低下します。

<参考>
一般的には、環状DNAを鋳型とする場合は、RRLが好ましいといわれます。WGEの反応は、RRLよりも高いマグネシウム、カルシウム濃度を必要とします（社内データ）。そのため、鋳型である環状DNAは高次構造（super coiled）を形成してしまい、その結果として、転写・翻訳の効率が低下する可能性があります。

参考文献：

5. Lancaster,J.M.et al.(1996)Nat.Genet.13, 238.
6. Sarkar,G.and Sommer,S.S.(1989)Science 244, 331.
7. Liu,B.et al.(1994)Cancer Res.54, 4590.
8. Papadopoulos,N.et al.(1994) Science 263,1625.
9. Roest,P.A.M.et al.(1993)Hum. Mol.Genet. 2, 1719.
10. van der Luijt,R.et al.(1994) Genomics 20, 1.
11. Hogervorst,F.B.L.et al.(1995) Nat.Genet.10, 208.
12. Lo Ten Foe,J.R.et al.(1996) Nat.Genet.14 ,320.